胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，每年因胃癌死亡的人数位居癌症死因第2位[1]。胃癌的发生发展是涉及多个基因的复杂过程，与抑癌基因的异常改变密切相关。肿瘤表观遗传学认为基因启动子区CpG岛甲基化是抑癌基因表达下调甚至失活的重要机制，但这种变化是可逆转的，去甲基化药物能够逆转抑癌基因启动子甲基化状态，恢复其正常表达[2]。死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）是一种凋亡正向调节分子，可被肿瘤坏死因子α、神经酰胺、细胞外基质（ECM）存活信号和pl9AFR5等多种因子激活，进而诱导凋亡[3]。有研究表明在头颈部肿瘤、胃癌、肺癌及膀胱癌等多种肿瘤细胞中，DAPK启动子区域DNA高甲基化水平与该基因表达沉默有关[4-7]。Satoh等[8]发现15%的胃癌组织存在DAPK基因启动子区CpG岛甲基化。本文以人胃癌BGC803细胞株为研究对象，研究体外去甲基化药物5-杂氮-2'脱氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR）对胃癌细胞株增殖、凋亡及细胞中DAPK基因的表达影响，为探讨胃癌的发生发展机制及治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

BGC803细胞来源于中国医科大学遗传学教研室，5-Aza-CdR购自美国Sigma公司，CCK-8购自北京碧云天公司，RPMI1640培养基购自Gibco公司，总RNA提取试剂盒，RT-PCR试剂盒，GoTaq Master Mix购自美国Promega公司，AnnexinⅤ-FITC凋亡检测试剂盒购自北京宝赛公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组及药物处理RPMI1640培养液（含10%小牛血清，100 μ/mL青霉素，100 μ/mL链霉素）在37℃，5%CO2饱和湿度条件下培养BGC803细胞。培养至60%汇合度时，对照组使用不含5-Aza-CdR的普通完全培养液，实验组分别为加入不同浓度5-Aza-CdR处理液分别记为5-Aza-CdR 1 μmol/L组、5-Aza-CdR 5 μmol/L组、5-Aza-CdR 10 μmol/L组，每隔24小时换液1次。

1.2.2 CCK-8检测细胞增殖变化将各组BGC803细胞按1500/孔接种96孔板，每组设3个复孔，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在细胞培养箱内孵育4 h，测定450 nm波长OD值，连测3 d，以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。以上实验重复3次。

1.2.3 AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率变化细胞传代24 h后，实验组将5-Aza-CdR 10μmol/L浓度配制的培养液加入培养瓶中，对照组换普通培养掖，每24小时换液1次。待72 h后分别回收细胞，制成单细胞悬液，再用PBS离心洗涤，调整待测细胞密度为1×106个/mL。取1 mL细胞，1000 r/min,4℃离心10 min，弃上清液，加入PBS清洗细胞2次，将细胞重悬于100 μL结合缓冲液，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和10 μL PI轻轻混匀，避光室温孵育15 min后，加入400 μL结合缓冲液，立即FCM检测。

1.2.4 半定量RT-PCR检测各组细胞DAPK mRNA表达变化用总RNA提取试剂盒提取5-Aza-CdR 10 μmol/L组不同处理时间（0、24、48、72 h）的细胞内RNA，用两步法将RNA逆转成cDNA后进行PCR实验，DAPK引物序列为5'-GATAGAAATGTCCCCAAA-3'（上游）；5'-TCTTCTTTGGATCCTTGA-3'（下游），长度为343 bp。作为内参的人β-actin引物序列为5'-CCAGATCATGTTTGAGACCT-3'（上游）；5'-TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3'（下游），长度为480 bp。扩增反应条件：95℃ 5 min变性，95℃复性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃延伸10 min，4℃暂时保存。实验重复3次。产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统（Tanon-2500 R）拍照及分析表达情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件，正态分布计量资料以均数±标准差（s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5-Aza-CdR对胃癌细胞株BGC803增殖的影响

与对照组比较，5-Aza-CdR 5 μmol/L组和5-Aza-CdR 10 μmol/L组的细胞在药物作用72 h后增殖力显著降低（P＜0.05）。而且随药物浓度的增加，细胞的生长抑制越明显。见图1。

图1 5-Aza-CdR对胃癌BGC803细胞增殖的影响

2.2 5-Aza-CdR对胃癌细胞株BGC803凋亡率的影响

实验组的细胞在药物处理72 h后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。对照组和实验组的细胞凋亡率分别为（5.）%和（10.）%，实验组细胞凋亡率较对照组显著增加（P＜0.05）。见图2。

2.3 5-Aza-CdR对胃癌BGC803细胞DAPK mRNA表达的影响

半定量RT-PCR结果表明，BGC803细胞在正常培养条件下DAPK基因表达明显受到抑制，10 μmol/L的5-Aza-CdR处理后，细胞DAPK mRNA表达水平明显升高[0 h：（0.），24 h：（0.），48 h：（0.），72 h：（0.）]，差异有统计学意义（P＜0.05），且有时间依赖性。见图3。